Разграничение областей применимости световой и атомно-силовой микроскопии в оценке гемин-индуцированных изменений эритроцитов

Цель исследования. Сравнить возможности световой и атомно-силовой микроскопии (АСМ) в оценке морфологических признаков повреждения эритроцитов.

Материалы и методы. В исследовании использовали кровь трех здоровых доноров мужского пола, средний возраст составил 36 ± 5 лет. Эритроциты инкубировали с раствором гемина в течении 60 мин. После инкубации готовили мазки крови. Морфологический анализ проводили с использованием светового микроскопа Olympus CX41. Топографию эритроцитов оценивали методом атомно-силовой микроскопии на приборе NTEGRA BIO в полуконтактном режиме. Анализировали распределение морфологических форм, диаметр, высоту клеток.

Результаты. В контрольной группе выявили преобладание дискоцитов обоими видами микроскопии: световая микроскопия — 94 ± 2 %, АСМ — 94 ± 1 %. После воздействия гемина по данным световой микроскопии 96 ± 2 % клеток утратили центральное просветление и их классифицировали как планоциты. Однако АСМ показала, что эти клетки были сфероэхиноцитам (98 ± 1 %), характеризующимися уменьшением диаметра с 7,6 ± 0,6 мкм до 5,9 ± 0,4 мкм (p = 0,008), увеличением высоты с 356 ± 22 нм до 737 ± 148 нм (p = 0,047) и наличием множественных выступов на мембране.

Заключение. Световая микроскопия выявляет утрату центрального просветления, но не позволяет верифицировать истинную трехмерную форму поврежденных клеток. Атомно-силовая микроскопия необходима для уточнения морфологической классификации, количественной оценки высоты и диаметра. Таким образом, световая микроскопия пригодна для первичного скрининга, АСМ — для детальной оценки.

1. Ghosh B., Agarwal K. Viewing life without labels under optical microscopes. Commun Biol. 2023; 6 (1): 559. DOI: 10.1038/s42003-023-04934-8. PMID: 37231084.

2. Balasubramanian H., Hobson C.M., Chew T.-L., Aaron J.S. Imagining the future of optical microscopy: everything, everywhere, all at once. Commun Biol. 2023; 6 (1): 1096. DOI: 10.1038/s42003-023-05468-9. PMID: 37898673.

3. Noble C.A., Biesemier A.P., McClees S.F., Alhussain A.M., Helms S.E., Brodell R.T. The history of the microscope reflects advances in science and medicine. Semin Diagn Pathol. 2025; 42 (2): 150831. DOI: 10.1053/j.semdp.2024.01.002. PMID: 38627186.

4. Robertson L.A. Antoni van Leeuwenhoek 1723-2023: a review to commemorate Van Leeuwenhoek’s death, 300 years ago: for submission to Antonie van Leeuwenhoek journal of microbiology. Antonie Van Leeuwenhoek. 2023; 116 (10): 919–935. DOI: 10.1007/s10482-023-01859-4. PMID: 37525002.

5. Somssich M. A short history of plant light microscopy. Curr. Protoc. 2022; 2 (10): e577. DOI: 10.1002/cpz1.577. PMID: 36200878.

6. Hou W., Wei Y. Evaluating the resolution of conventional optical microscopes through point spread function measurement. iScience. 2023; 26 (10): 107976. DOI: 10.1016/j.isci.2023.107976. PMID: 37822495.

7. Jayakumar N., Ahluwalia B.S. From superior contrast to super resolution label free optical microscopy. Npj Imaging. 2025; 3 (1): 1. DOI: 10.1038/s44303-024-00064-w. PMID: 40604121.

8. Astratov V.N., Sahel Y.B., Eldar Y.C., Huang L., Ozcan A., Zheludev N., Zhao J., et al. Roadmap on label-free super-resolution imaging. Laser Photonics Rev. 2023; 17 (12): 2200029. DOI: 10.1002/lpor.202200029. PMID: 38883699.

9. Hsieh H.-C., Han Q., Brenes D., Bishop K.W., Wang R., Wang Y., Poudel C., et al. Imaging 3D cell cultures with optical microscopy. Nat Methods. 2025; 22 (6): 1167–1190. DOI: 10.1038/s41592-025-02647-w. PMID: 40247123.

10. Shaked N.T., Boppart S.A., Wang L.V., Popp J. Label-free biomedical optical imaging. Nat Photonics. 2023; 17 (12): 1031–1041. DOI: 10.1038/s41566-023-01299-6. PMID: 38523771.

11. Wang Y., Zhang X., Xu J., Sun X., Zhao X., Li H., Liu Y., et al. The development of microscopic imaging technology and its application in micro- and nanotechnology. Front Chem. 2022; 10: 931169. DOI: 10.3389/fchem.2022.931169. PMID: 35864864.

12. Cuny A.P., Schlottmann F.P., Ewald J.C., Pelet S., Schmoller K.M. Live cell microscopy: from image to insight. Biophys Rev (Melville). 2022; 3 (2): 021302. DOI: 10.1063/5.0082799. PMID: 38505412.

13. Bourn M.D., Daly L.F., Huggett J.F., Braybrook J., Rivera J.F. Evaluation of image analysis tools for the measurement of cellular morphology. Front Cell Dev Biol. 2025; 13: 1572212. DOI: 10.3389/fcell.2025.1572212. PMID: 40443732.

14. Persano F., Parodi A., Pallaeva T., Kolesova E., Zamyatnin A.A., Pokrovsky V.S., De Matteis V., et al. Atomic force microscopy: a versatile tool in cancer research. Cancers (Basel). 2025; 17 (5): 858. DOI: 10.3390/cancers17050858. PMID: 40075706.

15. Sergunova V., Leesment S., Kozlov A., Inozemtsev V., Platitsina P., Lyapunova S., Onufrievich A., et al. Investigation of red blood cells by atomic force microscopy. Sensors (Basel). 2022; 22 (5): 2055. DOI: 10.3390/s22052055. PMID: 35271203.

16. Garcia R., Tejedor J.R. Advances in nanomechanical property mapping by atomic force microscopy. Nanoscale Adv. 2025; 7 (20): 6286–6307. DOI: 10.1039/D5NA00702J. PMID: 40880595.

17. Efremov Y.M., Suter D.M., Timashev P.S., Raman A. 3D nanomechanical mapping of subcellular and sub-nuclear structures of living cells by multi-harmonic AFM with long-tip microcantilevers. Sci Rep. 2022; 12 (1): 529. DOI: 10.1038/s41598-021-04443-w. PMID: 35017598.

18. Yang Q., Chen D., Li C., Liu R., Wang X. Mechanism of hypoxia-induced damage to the mechanical property in human erythrocytes-band 3 phosphorylation and sulfhydryl oxidation of membrane proteins. Front Physiol. 2024; 15: 1399154. DOI: 10.3389/fphys.2024.1399154. PMID: 38706947.

19. Dinarelli S., Longo G., Francioso A., Mosca L., Girasole M. Mechanotransduction boosts the aging effects in human erythrocytes submitted to mechanical stimulation. Int J Mol Sci. 2022; 23 (17): 10180. DOI: 10.3390/ijms231710180. PMID: 36077573.

20. He L., Yu Z., Zhu J., Cao X., Song X. Nanostructure and nanomechanics of Prorocentrum donghaiense and their changes under nitrogen limitation by atomic force microscopy. Front Mar Sci. 2022; 9: 874888. DOI: 10.3389/fmars.2022.874888.

21. Mikhailova D.M., Skverchinskaya E., Sudnitsyna J., Butov K.R., Koltsova E.M., Mindukshev I.V., Gambaryan S. Hematin- and hemin-induced spherization and hemolysis of human erythrocytes are independent of extracellular calcium concentration. Cells. 2024; 13 (6): 554. DOI: 10.3390/cells13060554. PMID: 38534398.

22. Georgiou-Siafis S.K., Samiotaki M.K., Demopoulos V.J., Panayotou G., Tsiftsoglou A.S. Glutathione-hemin/hematin adduct formation to disintegrate cytotoxic oxidant hemin/hematin in human K562 cells and red blood cells’ hemolysates: impact of glutathione on the hemolytic disorders and homeostasis. Antioxidants (Basel). 2022; 11 (10): 1959. DOI: 10.3390/antiox11101959. PMID: 36290682.

23. Guo Y., Zhao H., Lin Z., Ye T., Xu D., Zeng Q. Heme in cardiovascular diseases: a ubiquitous dangerous molecule worthy of vigilance. Front Cell Dev Biol. 2021; 9: 781839. DOI: 10.3389/fcell.2021.781839. PMID: 35127704.

24. Wiatr M., Hadzhieva M., Lecerf M., Noé R., Justesen S., Lacroix-Desmazes S., Dragon-Durey M.-A. et al. Hyperoxidized species of heme have a potent capacity to induce autoreactivity of human IgG antibodies. Int J Mol Sci. 2023; 24 (4): 3416. DOI: 10.3390/ijms24043416. PMID: 36834827.

25. Giri R.P., Chowdhury S., Mukhopadhyay M.K., Chakrabarti A., Sanyal M.K. Ganglioside GM1 drives hemin and protoporphyrin adsorption in phospholipid membranes: a structural study. J Phys Chem B. 2024; 128 (11): 2745–2754. DOI: 10.1021/acs.jpcb.3c08239. PMID: 38447189.

26. Мороз В.В., Козлова Е.К., Черныш А.М., Гудкова О.Е., Бушуева А.В. Изменения структуры мембран эритроцитов при действии гемина. Общая реаниматология. 2012; 8 (6): 5–10. DOI: 10.15360/1813-9779-2012-6-5.

27. Шерстюкова Е.А., Иноземцев В.А., Козлов А.П., Гудкова О.Е., Сергунова В.А. Атомно-силовая микроскопия в оценке механических свойств мембран эритроцитов при воздействии различных физико-химических агентов. Альманах клинической медицины. 2021; 49 (6): 427–434. DOI: 10.18786/2072-0505-2021-49-059.

28. Kozlova E., Sergunova V., Sherstyukova E., Gudkova O., Kozlov A., Inozemtsev V., Lyapunova S. et al. Topological relationships cytoskeleton-membrane nanosurface-morphology as a basic mechanism of total disorders of RBC structures. Int J Mol Sci. 2022; 23 (4): 2045. DOI: 10.3390/ijms23042045. PMID: 35216154.

29. Giri A., Tamgadge S. Red blood cells in health and disease. J Microsc Ultrastruct. 2025; 13 (3): 130-136. DOI: 10.4103/jmau.jmau_70_23. PMID: 41059161.

30. Strijkova-Kenderova V., Todinova S., Andreeva T., Bogdanova D., Langari A., Danailova A., Krumova S., et al. Morphometry and stiffness of red blood cells-signatures of neurodegenerative diseases and aging. Int J Mol Sci. 2021; 23 (1): 227. DOI: 10.3390/ijms23010227. PMID: 35008653.

31. Buys A.V., Van Rooy M.J., Soma P., Van Papendorp D., Lipinski B., Pretorius E. Changes in red blood cell membrane structure in type 2 diabetes: a scanning electron and atomic force microscopy study. Cardiovasc Diabetol. 2013; 12: 25. DOI: 10.1186/1475-2840-12-25. PMID: 23356738.

32. AlSalhi M.S., Devanesan S., AlZahrani K.E., AlShebly M., Al-Qahtani F., Farhat K., Masilamani V. Impact of diabetes mellitus on human erythrocytes: atomic force microscopy and spectral investigations. Int J Environ Res Public Health. 2018; 15 (11): 2368. DOI: 10.3390/ijerph15112368. PMID: 30373127.

33. Tyrrell L., Rose G., Shukri A., Kahwash S.B. Morphologic changes in red blood cells: an illustrated review of clinically important light microscopic findings. Malays J Pathol. 2021; 43 (2): 219–239. PMID: 34448787.

34. Rey-Barroso L., Roldán M., Burgos-Fernández F.J., Isola I., Ruiz Llobet A., Gassiot S., Sarrate E. et al. Membrane protein detection and morphological analysis of red blood cells in hereditary spherocytosis by confocal laser scanning microscopy. Microsc Microanal. 2023; 29 (2): 777–785. DOI: 10.1093/micmic/ozac055. PMID: 37749743.

35. Rahman S., Azam B., Khan S.U., Awais M., Ali I., Ul Hussen Khan R.J. Automatic identification of abnormal blood smear images using color and morphology variation of RBCS and central pallor. Comput Med Imaging Graph. 2021; 87: 101813. DOI: 10.1016/j.compmedimag.2020.101813. PMID: 33279759.

36. Su S., Zhao J., Ly T.H. Scanning probe microscopies for characterizations of 2D materials. Small Methods. 2024; 8 (13): 2400211. DOI: 10.1002/smtd.202400211.

37. Longo G., Dinarelli S., Collacchi F., Girasole M. Comparing nanomechanical properties and membrane roughness along the aging of human erythrocytes. Methods Protoc. 2025; 8 (4): 86. DOI: 10.3390/mps8040086. PMID: 40863736.

38. Kassa T., Jana S., Baek J.H., Alayash A.I. Impact of cold storage on the oxygenation and oxidation reactions of red blood cells. Front Physiol. 2024; 15: 1427094. DOI: 10.3389/fphys.2024.1427094. PMID: 39224206.

39. Liu S.C., Zhai S., Lawler J., Palek J. Hemin-mediated dissociation of erythrocyte membrane skeletal proteins. J Biol Chem. 1985; 260 (22): 12234–12239. DOI: 10.1016/S0021-9258 (17)39015-4. PMID: 4044594.

40. Li Y., Lu L., Li J. Topological structures and membrane nanostructures of erythrocytes after splenectomy in hereditary spherocytosis patients via atomic force microscopy. Cell Biochem Biophys. 2016; 74 (3): 365–371. DOI: 10.1007/s12013-016-0755-4. PMID: 27557951.

41. Demchenkov E.L., Nagdalian A.A., Budkevich R.O., Oboturova N.P., Okolelova A.I. Usage of atomic force microscopy for detection of the damaging effect of CdCl2 on red blood cells membrane. Ecotoxicol Environ Saf. 2021; 208: 111683. DOI: 10.1016/j.ecoenv.2020.111683. PMID: 33396015.

42. Giosheva I., Strijkova V., Komsa-Penkova R., Krumova S., Langari A., Danailova A., Taneva S.G. et al. Membrane lesions and reduced life span of red blood cells in preeclampsia as evidenced by atomic force microscopy. Int J Mol Sci. 2023; 24 (8): 7100. DOI: 10.3390/ijms24087100. PMID: 37108270.

43. Sinha A., Chu T.T.T., Dao M., Chandramohanadas R. Single-cell evaluation of red blood cell bio-mechanical and nano-structural alterations upon chemically induced oxidative stress. Sci Rep. 2015; 5: 9768. DOI: 10.1038/srep09768. PMID: 25950144.