ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК И ПРОЦЕССЫ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ ЛЕЙКОЦИТОВ У ПОСТРАДАВШИХ С ТЯЖЕЛОЙ ТРАВМОЙ

Цель исследования. Изучить механизмы развития посттравматических изменений в клетках крови путем исследования ДНКповреждений, связанных с гипоксией, вызванной массивной кровопотерей при тяжелой травме.

Материалы и методы. Для исследования ДНКповреждений, процессов некроза и апоптоза белых клеток крови было обследовано 95 больных в возрасте 40,6±16,5 лет (от 20 до 79 лет), перенесших тяжелую механическую травму с различными объемами потери крови (от 100 до 4000 мл) и нарушениями гемодинамики. Среднее значение потери крови (ПК) с учетом веса пострадавших составило 21,5±16,5 мл/кг (от 1,4 до 61,5 мл/кг). Пострадавшие были разделены в зависимости от объема потери крови на четыре группы: КП I СТ (кровопотеря I степени тяжести) — 26 пострадавших, объем потери крови (ОПК) составил меньше 750 мл (5,93±2,41 мл/кг); КП II СТ — 23 пострадавших, ОПК составил 750—1500 мл (11,5±1,5 мл/кг); КП III СТ — 23 пострадавших, ОПК составил 1500—2000 мл (23,8±4,0 мл/кг);КП IV СТ (кровопотеря IV степени тяжести) — 23 пострадавших, ОПК составил более 2000 мл (45,6±10,1 мл/кг); в зависимости от вида травмы: ТСТ (тяжелая скелетная травма) — 17 пострадавших, ЧМТ (черепномозговая травма) — 43 пострадавших, ТСТ+ЧМТ (сочетание тяжелой скелетной и черепномозговой травм) — 35 пострадавших. В зависимости от развития инфекционных осложнений: инфекция «+» — 69 пострадавших у которых на 5—7е сутки после травмы развились инфекционные осложнения; инфекции «» — 26 пострадавших. Для оценки влияния гипоксии на ДНКповреждения, процессы апоптоза и некроза белых клеток крови общая группа пострадавших с травмой была разделена на 2 группы: гипоксия «+» — 18 пострадавших; гипоксии «» — 10 пострадавших, у которых при поступлении в реаниматологическое отделение все 4 показателя (рО2 в капиллярной крови, уровень лактата, рН и ВЕ плазмы крови) были в пределах нормы. ДНКповреждения, некротические и апоптотические изменения в белых клетках крови оценивали методом ДНКкомет. Концентрацию внеклеточной ДНК в плазме крови определяли флуориметрически, с использованием набора QuantiT™ HS DNA Assay Kit (Invitrogen, США). Содержание 8гидрокси2дезоксигуанозина в плазме крови определяли с помощью иммуноферментного метода с использованием набора 8hydroxy 2deoxyGuanosine EIA Kit (Cayman Chemical, США). Содержание каспазы3, каспазы9, супероксиддисмутазы и sAPO1/FAS определяли с помощью иммуноферментного метода с использованием тестсистем фирмы Bender MedSystems (Австрия).

Результаты. Выявлено повышение содержания свободной ДНК в плазме крови пострадавших относительно контроля на протяжении всего периода наблюдения, что обусловлено ее поступлением из клеток, поврежденных в результате травмы тканей. В первые две недели после травмы отмечено увеличение ДНКповреждений и усиление процессов гибели белых клеток крови по некротическому и апоптотическому механизму у пострадавших с различными видами травмы, что, возможно, связано с активным участием лейкоцитов в процессах удаления продуктов клеточного распада поврежденных в результате травмы тканей и предупреждения развития инфекционных осложнений. Гибель белых клеток крови у пострадавших с травмой по некротическому пути не зависит от объема потери крови и степени гипоксии, в то время как по апоптотическому механизму выявлена интенсивность гибели лейкоцитов у этих больных от гипоксии. Вероятность развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой при кровопотере и гипоксии определяется количеством некротических ДНКкомет и значениями интегрального показателя на 3й день после травмы. Количество апоптотических ДНКкомет белых клеток крови в первый день после травмы зависит от объема потери крови и степени гипоксии. Не выявлено зависимости инфекционных осложнений у пострадавших с травмой от количества апоптотических ДНКкомет в 1й день после травмы. Выявлены различия в уровнях ДНК повреждений, апоптоза и некроза в белых клетках крови у пострадавших с ЧМТ и ТСТ. Массивные повреждения костей и тканей при тяжелой сочетанной травме сопровождается более выраженными изменениями ДНК повреждений в первую неделю после травмы и постепенным снижением показателей ДНКповреждений — во вторую неделю. Выявлено трехкратное снижение концентрации 8гидрокси2дезоксигунозина в плазме крови пострадавших с травмой, сопровождающееся и, возможно, обусловленное, увеличением количества супероксиддисмутазы.

Заключение. Выявлена зависимость выраженности ДНКповреждений, апоптоза и некроза от гипоксии, а также развитие инфекционных осложнений у пострадавших с гипоксией, вызванной массивной кровопотерей при тяжелой травме.

1. Proskuryakov S., Konoplyannikov A.G., Gabai V.L. Necrosis: a specific form of programmed cell death? Exp. Cell Res. 2003; 283 (1): 1–16. http://dx.doi.org/10. 1016/S0014—4827(02)00027—7. PMID: 12565815

2. Sabzi F., Niazi M., Zokaei A.H., Sahebjamee F., Bazargan Hejazi S., Ahmadi A. Ventricular septal necrosis after blunt chest trauma. J. Inj. Violence Res. 2012; 4 (2): 98—100. http://dx.doi.org/10.5249/jivr.v4i2.97. PMID: 22071450

3. Novikov V.S. Programirovannaya kletochnaya gibel. [Programmed cell death]. SanktPeterburg: Nauka; 1996: 276. [In Russ.]

4. Gewies A. Introduction to apoptosis. ApoReview. 2003; 1—26.

5. Chaabane W., User S.D., El Gazzah M., Jaksik R., Sajjadi E., Rzeszowska Wolny J., Los M.J. Autophagy, apoptosis, mitoptosis and necrosis: interdependence between those pathways and effects on can cer. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.). 2013; 61 (1): 43–58. http://dx.doi.org/10.1007/s00005—012—0205y. PMID: 23229678

6. Rastogi R.P., Sinha R.P. Apoptosis molecular mechanisms and patho genicity. EXCLI J. 2009; 8: 155—181.

7. Tamakovich S.N., Vlasov V.V., Laktionov P.P. Tsirkuliruyushchie DNK krovi i ikh ispolzovanie v meditsinskoi diagnostike. [Circulating deoxyribonucleic acids in blood and their using in medical diagnos tics]. Molekulyarnaya Biologiya. 2008; 42 (1): 12—23. PMID: 18389615. [In Russ.]

8. Borovkova N.V., Valetova V.V., Timerbayev V.Kh., Kazakov M.G., Nikitina O.V., Khvatov V.B. Reaktsiya leikotsitov i apoptoz limfotsitov perifericheskoi venoznoi krovi kak marker tkanevoi ishemii pri ostroi massivnoi krovopotere. Obshchaya Reanimatologiya. [Leukocytic response and peripheral venous blood lymphocyte apoptosis as a mark er of tissue ischemia in acute massive blood loss. General Reanimatology]. 2013; 9 (4): 18—22. [In Russ.]

9. Summers C., Rankin S.M., Condliffe A.M., Singh N., Peters A.M., Chilvers E.R. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 2010; 31 (8): 318–324. http://dx.doi.org/10.1016/j.it.2010.05.006. PMID:20620114 10. von Vietinghoff S., Ley K. Homeostatic regulation of blood neutrophil counts. J. Immunol. 2008; 181 (8): 5183—5188. http://dx.doi.org/10.4049/jimmunol.181.8.5183. PMID: 18832668

10. Gostishchev V.K., Kosinets V.A., Matusevich E.A., Adamenko G.P. Immunologicheskie aspekty eksperimentalnogo gnoinogo peritonita. [Immunological aspects of experimental purulent peritonitis]. Novosti Khirurgii. 2011; 19 (5): 3—8. [In Russ.]

11. Redwan M., Odemuyiwa S.O., Lacy P., Adamko D.J. The human eosiniphil. In: Greer J.P., Foerster J., Rodgers G.M., Paraskevas F., Glader B., Arber D.A., Means R.T. Wintrobe’s Clinical Hematology. vol. 1. Philadelphia, USA: Lippincott Wiliams and Wilkins; 2009: 217—223.

12. Taylor G.A., Weinberg J.B. Phagocytosis. In: Greer J.P., Foerster J., Rodgers G.M., Paraskevas F., Glader B., Arber D.A., Means R.T.

13. Wintrobe’s Clinical Hematology. vol. 1. Philadelphia, USA, Lippincott Wiliams and Wilkins. 2009: 281—300.

14. Ryabov G.A. Gipoksiya kriticheskikh sostoyanii. [Hypoxia in critical conditions]. Moscow: Meditsina Publishers; 1988: 287. [In Russ.]

15. Yakovlev A.Yu., Kichin V.V., Nikolsky V.O., Kalentyev G.V., Ryabikov D.V., Ryabikova M.A., Protasov D.M., Galanina T.A., Smorkalov A.Yu., Evdokimova O.S. Effektivnost primeneniya sterofundina izotonich eskogo posle ostroi massivnoi krovopoteri v eksperimente. Obshchaya Reanimatologiya. [Efficacy of employment of isotonic sterofundin after experimental hemorrhagic shock. General Reanimatology]. 2013; 9 (3):24—29. [In Russ.]

16. Tokmakova T.O., Permyakova S.Yu., Kiseleva A.V., Shukevich D.L., Grigoryev E.V. Monitoring mikrotsirkulyatsii v kriticheskikh sostoy aniyakh: vozmozhnosti i ogranicheniya. Obshchaya Reanimatologiya. [Microcirculation monitoring in critical conditions: Possibilities and limitations. General Reanimatology]. 2012; 8 (2): 74—78. [In Russ.]

17. Kasai H., Hirano T., Kawai K., Tsurudome Y., Itoh H., Himeji D., Horiuchi T. Analysis of 8Hydroxy2deoxyguanosine as a marker of oxidatively damaged DNA in relation to carcinogenesis and aging. In: Evans M.D., Cooke M.S. Oxidative damage to nucleic acids. USA: Landes Bioscience and Springer Science Business Media; 2007: 178—187.

18. Kapitonov V.M., Ostapchenko D.A. «Okislitelnyi stress» i ego korrekt siya u bolnykh s tyazheloi sochetannoi travmoi. Obshchaya Reanimatologiya. [Oxidative stress and its correction in patients with severe concomitant injury. General Reanimatology]. 2010; 6 (4): 70—75. [In Russ.]

19. Shin C.S., Moon B.S., Park K.S., Kim S.Y., Park S.J., Chung M.H., Lee H.K. Serum 8hydroxyguanine levels are increased in diabetic patients. Diabetes Care. 2001; 24 (4): 733—737. PMID: 11315839

20. Rivera M., Roselló Lletí E., García de Burgos F., Bertomeu V., Payá R., Cortés R., Martínez Dolz L., Jordán A., Pérez Boscá J. L., Salvador A., Marín F., Sogorb F., Valero R., Miró V., Portolés M. 8Hydroxy2’deoxyguanosine and

21. lipid peroxidation in patients with heart failure. Rev. Esp. Cardiol. (Engl. Ed.). 2006; 59 (11): 1140—1145. http://dx.doi.org/10.1016/S1885—5857(07)60063—2. PMID: 17144989

22. Valavanidis A., Vlachogianni T., Fiotakis C. 8hydroxy2’ deoxyguano sine (8OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcino genesis. J. Environ. Sci. Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 2009; 27 (2): 120—139. http://dx.doi.org/10.1080/10590500902885684. PMID: 19412858

23. Zhanataev A.K., Durnev A.D., Seredenin S.B. Perspektivy opredeleniya 8 gidroksi2dezoksiguanozina v kachestve biomarkera okislitelnogo stressa v eksperimente i klinike. [Prospects of experimental and clinical determi nation of 8hydroxy2deoxyguanosine as a biological marker of oxidative stress]. Vestnik RAMN. 2002; 2: 45—49. PMID: 11924129. [In Russ.]

24. Rady M.Y. The role of central venous oximetry, lactic acid concentra tion and shock index in the evaluation of clinical shock: a review. Resuscitation. 1992; 24 (1): 55—60. PMID: 1332162

25. Gutierrez G., Reines H.D., Wulf Gutierrez M.E. Clinical review: hemor rhagic shock. Crit. Care. 2004; 8 (5): 373–381. PMID: 15469601

26. Levite E.M., Bobrinskaya I.G., Chernova E.A. Operatsionnaya krovopoterya: izmerenie, lechenie. [Operative blood loss: Measurement, treatment]. Rossiisky Meditsinsky Zhurnal. 2006; 3: 16—19. [In Russ.]

27. Zhanataev A.K., Moroz V.V., Durnev A.D., Muravyeva M.Yu., Reshetnyak V.I. DNA damage and cell death assessment in patients with severe multiple trauma using comet assay: a pilot study. Medicina Danas. 2009; 8 (10—12): 361—368.

28. Sorochinskaya U.B., Mikhailenko V.M. Primenenie metoda DNKkomet dlya otsenki povrezhdenii DNK, vyzvannykh razlichnymi agentami okruzhayushchei sredy. [Use of DNA comet method to evaluate DNA damages caused by different environmental agents]. Onkologiya. 2008; 10 (3): 303—309. [In Russ.]

29. Glants S. Medikobiologicheskaya statistika. [Biomedical statistics]. Moscow: Praktika; 1999. [In Russ.]

30. Khubutia M.Sh., Shabanov A.K., Skulachev M.V., Bulava G.V., Savchenko I.M., Grebenchikov O.A., Sergeev A.A., Zorov D.B., Zinovkin R.A. Mitokhondrialnaya i yadernaya DNK u postradavshikh s tyazh eloi sochetannoi travmoi. Obshchaya Reanimatologiya. [Mitochondrial and nuclear DNA in patients with severe polytrauma. General Reanimatology]. 2013; 9 (6): 24—29. [In Russ.]

31. Galkin A.A., Demidova V.S. Povrezhdenie zashchitnykh funktsii neitro filov na rannei stadii ozhogovoi bolezni. [Protective neutrophil dys function in the early stage of burn disease]. Uspekhi Sovremennoi Biologii. 2012; 132 (3): 297—311. [In Russ.]

32. Tronov V.A., Nikolskaya T.N., Konoplyannikov M.A. DNKkomety kak marker kletochnoi gibeli. [Dna comets as markers of cells death]. Biofizika. 1999; 44 (2): 288—295. PMID: 10418679. [In Russ.]

33. Afanasyev G.G., Ivanenko T., Krushevsky M., Pelevina I.I. Povrezhdeniya DNK, ikh reparatsiya i apoptoz v otdalennykh pokoleniyakh kletok L5178Y(R) posle radiatsionnogo vozdeistviya (metod DNKkomet). [DNA damages, their repair and apoptosis in the distant descendants of L5178Y(R) cells following radiation exposure (the DNAcomet method)]. Tsitologiya. 1997; 39 (8): 740—746. PMID: 9490513. [In Russ.]

34. Shabanov A.K., Khubutia M.Sh., Bulava G.V., Beloborodova N.V., Kuzovlev A.N., Grebenchikov O.A., Kosolapov D.A., Shpitonkov M.I. Dinamika urovnya prokaltsitonina pri razvitii nozokomialnoi pnev monii u postradavshikh s tyazheloi sochetannoi travmoi. Obshchaya Reanimatologiya. [Time course of changes in the level of procalcitonin in the development of nosocomial pneumonia in victims with severe concomitant injury in an intensive care unit. General Reanimatology]. 2013; 9 (5): 11—17. [In Russ.]