Комбинация молекулярных биомаркеров ДНК в прогнозе исхода критических состояний

Цель исследования: определить информативность предикции летальности пациентов с сепсисом с помощью комбинации кандидатных маркеров — количественного содержания циркулирующей внеклеточной ДНК (вкДНК) в плазме и аллельных вариантов гена TLR9, кодирующего ДНК-распознающий клеточный рецептор TLR9.
Материалы и методы. В исследование вошли пациенты из пяти ОРИТ четырех больниц (n=156). Пациентов разделили на 2 группы: (1) с сепсисом (по критериям СЕПСИС-3, 2016), (n=81) и с ОНМК (n=75). ВкДНК выделяли из плазмы пациентов органическими растворителями и определяли ее концентрацию на спектрофотометре, используя флуоресцентный интеркалирующий агент SYBR Green, связывающийся с ДНК с высокой аффинностью. Генотипирование аллельных вариантов гена TLR9 rs352162 проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием тетрапраймеров с последующим электрофоретическим разделением продуктов и их визуализацией. Значения концентраций вкДНК сопоставляли с результатами генотипирования по TLR9 rs352162 и исходом в течение 30 дней после госпитализации.
Результаты. По содержанию вкДНК пациенты с сепсисом (подгруппы с абдоминальным или неабдоминальным сепсисом) из двух разных больниц значимо не отличались, а концентрации вкДНК в группах пациентов не зависела от источника первичной инфекции, что позволило увеличить размеры групп, суммировав данные. При использовании объединенных данных показали, что чувствительность и специфичность прогнозирования летального исхода по определению содержания вкДНК зависит от генотипа: у гомозиготных пациентов генотипа TLR9 rs352162 CC величина AUC была значимо выше, чем в группе пациентов генотипов TLR9 CТ и TT (rs352162).
Заключение. Полученные данные свидетельствуют об информативности определения генетического полиморфизма TLR9 и обосновывают целесообразность подбора пациентов для исследований действия таргетных препаратов, ингибирующих взаимодействие вкДНК с рецептором TLR9 с учетом генотипа TLR9 пациента.

внеклеточная ДНК, полиморфизм TLR9, комбинация биомаркеров, сепсис, критические состояния

1. Jabaley C.S, Blum J.M., Groff R.F., O’Reilly-Shah VN. Global trends in the awareness of sepsis:insights from search engine data between 2012 and 2017. Crit Care. 2018; 22: 7. PMID: 29343292. DOI: 10.1186/s13054-017-1914-8.

2. Sandquist M, Wong H.R. Biomarkers of sepsis and their potential value in diagnosis, prognosis and treatment. Expert Rev Clin Immunol. 2014 Oct; 10(10): 1349-56. PMID:25142036. PMCID: PMC4654927. DOI: 10.1586/1744666X.2014.949675.

3. Nakada T.A., Takahashi W., Nakada E., Shimada T., Russell J.A., Walley K.R. Genetic Polymorphisms in Sepsis and Cardiovascular Disease: Do Similar Risk Genes Suggest Similar Drug Targets? Chest. 2019 Jan 17. pii: S0012-3692(19)30013-3. PMID: 30660782. DOI: 10.1016/j.chest.2019.01.003.

4. Dwivedi DJ, ToltlL.J., Swystun L.L., PogueJ., LiawK.L., Weitz J.I., Cook DJ, Fox-Robichaud AE, Liaw PC. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Crit Care. 2012; 16(4): R151. PMID: 22889177. PMCID: PMC3580740. DOI: 10.1186/cc11466.

5. Vajpeyee A., Wijatmiko T., Vajpeyee M., Taywade O. Cell free DNA: A Novel Predictor of Neurological Outcome after Intravenous Thrombolysis and/or Mechanical Thrombectomy in Acute Ischemic Stroke Patients. Neurointervention 2018 Mar;13(1): 13-19. PMID: 29535894. DOI: 10.5469/neuroint.2018.13.1.13.

6. Sanchis J., Garcia-Blas S., Ortega-Paz L., Dantas A.P., Rodriguez E., Abellan L., Brugaletta S., Valero E., Minana G., Garabito M., Corchon A., Nunez J., Carratala A., Sabate M. Cell-free DNA and Microvascular Damage in ST-segment Elevation Myocardial Infarction Treated With Primary Percutaneous Coronary Intervention. Rev Esp Cardiol (Engl Ed). 2018 Apr 11. PMID: 29655768. DOI: 10.1016/j.rec.2018.03.005.

7. Хубутия М.Ш., Шабанов А.К., Скулачев М.В., Булава Г.В., Савченко И.М., Гребенчиков О.А., Сергеев А.А., Зоров Д.Б., Зиновкин Р.А. Митохондриальная и ядерная ДНК у пострадавших с тяжелой сочетанной травмой. Общая реаниматология. 2013. (6): 24-35. DOI: 10.15360/1813-9779-2013-6-24.

8. Likhvantsev V.V, Landoni G., Grebenchikov O.A., Skripkin Y.V., Zabelina T.S., Zinovkina L.A., Prikhodko A.S, Lomivorotov V.V., Zinovkin R.A. Nuclear DNA as Predictor of Acute Kidney Injury in Patients Undergoing Coronary Artery Bypass Graft: A Pilot Study. J Cardiothorac Vasc Anesth. 2017 Dec; 31(6): 2080-2085. PMID: 28967626. DOI: 10.1053/j.jvca.2017.04.051.

9. Gilbert S. F., Barresi M.J.B. Chapter 15 Neural Crest Cells and Axonal Specificity. Developmental biology. Sunderland, MA, USA: Oxford University Press; 2016: 509-510.

10. Tamkovich S.N., Cherepanova A.V., Kolesnikova E.V., Rykova E.Y., Pyshnyi D.V., Vlassov V.V., LaktionovP.P. Circulating DNA and DNase activity in human blood. Ann N Y Acad Sci. 2006 Sep;1075:191-6. PMID: 17108211. DOI: 10.1196/anna!s.1368.026

11. Verhoven B., Schlegel RA., Williamson P. Mechanisms of phosphati-dylserine exposure, a phagocyte recognition signal, on apoptotic T lymphocytes. Journal of Experimental Medicine. Nov 1995, 182 (5) 1597-1601; PMID: 7595231. DOI:10.1084/jem.182.5.1597

12. van der VaarM, Pretorius PJ. Circulating DnA. Its origin and fluctuation. Ann N Y Acad Sci. 2008, 1137, P 18-26. PMID:18837919. DOI:10.1196/annals.1448.022

13. Hummel E.M., Hessas E., Muller S., Beiter T., Fisch M., Eibl A., Wolf O. T., Giebel B., Pla.ten P, Kumsta R., Moser D.A. Cell-free DNA release under psychosocial and physical stress conditions. Transl Psychiatry. 2018 Oct 29;8(1): 236. PMID: 30374018. DOI: 10.1038/s41398-018-0264-x.

14. Ferna.ndo M.R., Jia,ng C, Krzyzanowski G.D., Ryan W.L. New evidence that a large proportion of human blood plasma cell-free DNA is localized in exosomes. PLoS One. 2017; 12(8): PMID: 28850588. DOI: 10.1371/journal.pone.0183915.

15. Du X., Poltorak A., Wei Y., Beutler B. Three novel mammalian toll-like receptors: gene structure, expression, and evolution. Eur Cytokine Netw. 2000 Sep;11(3): 362-71. PMID:11022119.

16. Sabatel C., Radermecker C., Fievez L., Paulissen G., Chakarov S., Fernandes C., Olivier S., ToussaintM., Pirottin D., Xiao X., Quatresooz P, Sirard J.C., Ca.taldo D., Gillet L., Bouabe H, Desmet C.J., Ginhoux F., Marichal T, Bureau F. Exposure to Bacterial CpG DNA Protects from Airway Allergic Inflammation by Expanding Regulatory Lung Interstitial Macrophages. Immunity. 2017 Mar 21;46(3): 457-473. PMID: 28329706. DOI:10.1016/j.immuni.2017.02.016.

17. Plitas G., BurtBM., Nguyen H.M., BamboatZ.M., DeMatteo R.PToll-like receptor 9 inhibition reduces mortality in polymicrobial sepsis. J Exp Med. 2008 Jun 9;205(6): 1277-83. PMID:18474631. DOI: 10.1084/jem.20080162.

18. WeighardtH., Ka.iser-Moore S., Vabulas R.M., Kirschning C.J., Wagner H., Holzmann B. Cutting edge: myeloid differentiation factor 88 deficiency improves resistance against sepsis caused by polymicrobial infection. JImmunol. 2002 Sep 15;169(6): 2823-7. PMID: 12218091. DOI: 10.4049/jimmunol.169.6.2823

19. Chen K.H., Zeng L, Gu W., Zhou J., Du D. Y., Jiang J.X Polymorphisms in the toll-like receptor 9 gene associated with sepsis and multiple organ dysfunction after major blunt trauma. PMID: 21633947. Br J Surg. 2011 Sep;98(9): 1252-9. DOI: 10.1002/bjs.7532.

20. Singer M., Deutschma.n C.S., Seymour C.W., Shankar-Hari M., Annane D. , Bauer M., Bellomo R., Bernard G.R., Chiche J.D., Coopersmith C.M, HotchkissR.S., LevyM.M., MarshallJ.C., Martin G.S., OpalS.M., Ruben-feld G.D., van der Poll', Vincent J.L., Angus D.C. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 2016;315(8): 801-810. PMID: 26903338. DOI:10.1001/jama.2016.0287.

21. Napolitano L.M. Sepsis 2018: Definitions and Guideline Changes. Surg Infect (Larchmt). 2018 Feb/Mar;19(2): 117-125. PMID: 29447109 DOI: 10.1089/sur.2017.278.

22. AvrielA., Wiessman M. P, AlmogY., Perl Y., Novack V, Galante O., Klein M. , Pencina M. J., Douvdeva.ni A. Admission Cell Free DNA Levels Predict 28-Day Mortality in Patients with Severe Sepsis in Intensive Care. PLoS One. 2014; 9(6): e100514. PMID: 24955978. DOI:10.1371/jo-urnal.pone.0100514

23. BronkhorstM.W., BoyeN.D., LomaxM.A., Vossen R.H., Bakker J., Patka P, Van LieshoutEM. Single-nucleotide polymorphisms in the Toll-like receptor pathway increase susceptibility to infections in severely injured trauma patients. J Trauma Acute Care Surg. 2013 Mar;74(3): 86270. PMID: 23425749. DOI: 10.1097/TA.0b013e31827e1534.

24. Smelaya T.V., Belopolskaya O.B., Smirnova S.V, KuzovlevA.N., Moroz V.V, GolubevA.M., Pabalan N.A., SalnikovaL.E. Genetic dissection of host immune response in pneumonia development and progression. Sci Rep. 2016 Oct 11;6:35021. PMID: 27725770. DOI: 10.1038/srep35021.

25. Чумаченко А.Г., Мязин А.Е., Кузовлев А.Н., Гапонов А.М., Тутельян А.В., Пороховник Л.Н., Голубев А.М., Писарев В.М. Аллельные варианты генов NRF2 и TLR9 при критических состояниях. Общая реаниматология, 2016, том 12, №4, с.8-23. DOI: 10.15360/1813-9779-2016-4-8-23.

26. Ayala A., Herdon C.D., Lehman D.L., Ayala C.A., Chaudry I.H. Differential induction of apoptosis in lymphoid tissues during sepsis: variation in onset, frequency, and the nature of the mediators. Blood. 1996 May 15;87(10): 4261-75. PMID: 8639785.

27. Galluzzi L., Vitale I., Aaronson S.A., Abrams J.M., Adam D., Agostinis P., Alnemri E.S., Altucci L., Amelio I., Andrews D.W., Annicchiarico-Petruzzelli M., Antonov A.V., Arama E., Baehrecke E.H.,Barlev N.A., Bazan N.G. Bernassola F., Bertrand M.J.M.,.Bianchi K., Blagosklonny M.V., Blomgren K., Borner C.,Boya P., Brenner C., Campanella M.,Candi E., Carmona-Gutierrez D., Cecconi F., Chan F.K., Chandel N.S.,.Cheng E.H., Chipuk J.E., Cidlowski J.A., Ciechanover A., Cohen G.M., Conrad M., Cubillos-Ruiz JR.,.Czabotar P.E., D’Angiolella V., Dawson T.M.,. Dawson V.L., De Laurenzi V., De Maria R., Debatin K.M., DeBerardinis R.J., Deshmukh M., Di Daniele N., Di Virgilio F., Dixit V.M., Dixon S.J.,. Duckett C.S., Dynlacht B.D., El-Deiry W.S., Elrod J.W., Fimia G.M., Fulda S ,García-Sáez A.J. Garg AD, Garrido C, Gavathiotis E, Golstein P, Gottlieb E, Green DR, Greene LA, Gronemeyer H, Gross A, Hajnoczky G, Hardwick JM, Harris IS, Hengartner MO, Hetz C, Ichijo H, Jäättelä M, Joseph B, Jost PJ, Juin PP, Kaiser WJ. Karin M, Kaufmann T, Kepp O, Kimchi A, Kitsis RN, Klionsky DJ, Knight RA, Kumar S, Lee SW, Lemasters JJ, Levine B, Linkermann A, Lipton SA, Lockshin RA, López-Otín C, Lowe SW, Luedde T, Lugli E, MacFarlane M, Madeo F, Malewicz M, Malorni W, Manic G, Marine JC, Martin SJ, Martinou JC, Medema J.P., Mehlen P, Meier P., Melino S., Miao EA, Molkentin JD, Moll UM, Muñoz-Pinedo C,. Nagata S., Nuñez G., Oberst A., Oren , Overholtzer M, Pagano M., Panaretakis T., Pasparakis M., Penninger JM, Pereira DM, Pervaiz S., Peter M.E., Piacentini M., Pinton P., Prehn J.H.M., Puthalakath H., Rabinovich G.A., Rehm M., Rizzuto R, Rodrigues C.M.P., Rubinsztein D.C., Rudel T., Ryan K.M., Sayan E. Scorrano L, Shao F, Shi Y, Silke J, Simon HU, Sistigu A, Stockwell B.R., Strasser A., Szabadkai G., Tait S.W.G., Tang D., Tavernarakis N, Thorburn A, Tsujimoto Y., Turk B. Vanden Berghe T., Vandenabeele P., Vander Heiden M.G., Villunger A. Virgin H.W., Vousden K.H., Vucic D, Wagner E.F., Walczak H., Wallach D, Wang Y., Wells .JA., Wood W., Yuan J, Zakeri Z., Zhivotovsky B., Zitvogel L, Melino G, Kroemer G. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 2018 Mar; 25(3): 486–541.PMID: 29362479, doi: 10.1038/s41418-017-0012-4

28. Krychtiuk K.A., Ruhittel S., Hohensinner PJ., Koller L., Kaun C., Lenz M. , Bauer B., Wutzlhofer L., Draxler D.F., Maurer G., Huber K., Wojta J. , Heinz G., Niessner A., Speidl W.S. Mitochondrial DNA and Toll-Like Receptor-9 Are Associated With Mortality in Critically Ill Patients. Crit Care Med. 2015 Dec;43(12): 2633-41. PMID: 26448617 doi:10.1097/CCM.0000000000001311.

29. Surpris G., Poltorak A. The expanding regulatory network of STING-mediated signaling. Curr Opin Microbiol. 2016 Aug;32:144-150. PMID: 27414485; PubMed Central DOI: 10.1016/j.mib.2016.05.014.

30. Hamaguchi S., Akeda Y., Yamamoto N., Seki M., Yamamoto K., Oishi K. , Tomono K Origin of Circulating Free DNA in Sepsis: Analysis of the CLP Mouse Model. Mediators Inflamm., 015: 614518. PmID: 26273139. DOI: 10.1155/2015/614518.

31. SeeleyJ.J. Ghosh S. Molecular mechanisms of innate memory and tolerance to LPS. J Leukoc Biol. 2017 Jan; 101(1): 107-119. PMID: 27780875 DOI: 10.1189/jlb.3MR0316-118RR.

32. Johansson PI., Stensballe J., Ostrowski S.R. Shock induced endothe-liopathy (SHINE) in acute critical illness - a unifying pathophysiologic mechanism. Crit Care. 2017 Feb 9;21(1): 25. pMiD: 28179016. DOI: 10.1186/s13054-017-1605-5.

33. Xing C., Arai K, Lo E.H., Hommel M. Pathophysiologic cascades in ischemic stroke. Int J Stroke. 2012 Jul; 7(5): 378-385, PMID: 22712739. DOI: 10.1111/j.1747-4949.2012.00839.x

34. Khatri R., McKinney AM, Swenson B., Janardhan V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and haemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 2012 Sep 25;79(13 Suppl 1): S52-7. PMID: 23008413 DOI: 10.1212/WNL.0b013e3182697e70.

35. Powers W.J., Rabinstein A.A., Ackerson T., Adeoye O.M., Bambakidis N. C., Becker K., Biller J., Brown M., Demaerschalk B.M., Hoh B., Jauch E.C., Kidwell C.S., Leslie-Mazwi T.M, Ovbiagele B., Scott P.A., Sheth K.N., Southerla.ndA.M., SummersD.V, TirschwellD.LAmerican Heart Association Stroke Council. 2018 Guidelines for the Early Management of Patients With Acute Ischemic Stroke: A Guideline for Healthcare Professionals From the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 2018 Mar;49(3): e46-e110. PMID:29367334. DOI: 10.1161/STR.0000000000000158.

36. Krychtiuk K.A., Ruhittel S., Hohensinner PJ., Koller L., Kaun C., Lenz M., Bauer B., Wutzlhofer L., Draxler D.F., Maurer G., Huber K., Wojta J., Heinz G., Niessner A., Speidl W.S. Mitochondrial DNA and Toll-Like Receptor-9 Are Associated With Mortality in Critically Ill Patients. Crit Care Med. 2015 Dec; 43(12): 2633-41. PMID: 26448617 DOI: 10.1097/CCM.0000000000001311.

37. Zhong Z., Liang S., Sanchez-Lopez E., He F., Shalapour S., Lin X.J., Wong J., Ding S., Seki E., Schnabl B., Hevener A.L, Greenberg H.B, Kis-seleva T, Karin M. New mitochondrial DNA synthesis enables NLRP3 inflammasome activation. Nature. 2018 Aug;560(7717): 198-203. PMID: 30046112, DOI: 10.1038/s41586-018-0372-z