3D сфероиды - клеточная модель для изучения воздействия гипоксии на эпикардиальное микроокружение

Фундаментальные исследования последних лет позволили переосмыслить молекулярные и клеточные механизмы онтогенеза сердца и его репарации после повреждения. Особую актуальность приобретает изучение эпикарда — наружного, плотно примыкающего к миокарду слоя сердечной стенки, образованного гетерогенной популяцией клеток эпикардиального мезотелия, коллагеновыми и эластическими волокнами, являющегося важным участником репаративных процессов. Изучение эпикарда затруднено в связи с анатомическими ограничениями и отсутствием релевантных клеточных моделей.

Цель исследования. Разработка 3D модели эпикардиального микроокружения и оценка влияния гипоксии на ее характеристики.

Материал и методы. Сборку сфероидов проводили в V-образных культуральных чашках с низкоадгезионным покрытием. Характеристику сфероидов выполняли с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания криосрезов, гистологических методов, ПЦР в реальном времени.

Результаты. Культивирование клеток в низкоадгезионных условиях в V-образных культуральных чашках ведет к формированию сфероидов, имеющих размер 136±21 мкм и показатели жизнеспособности клеток более 98%. Клетки в составе сфероидов, культивированных в условиях нормоксии, образовывали плотные межклеточные контакты, характеризовались низким уровнем пролиферации и способностью синтезировать белки внеклеточного матрикса. В условиях гипоксии клетки сфероидов частично утрачивали межклеточные контакты, приобретали веретенообразную форму, экспрессировали HIF1a, SNAI1, ACTA2, FN1, COL1A1 и накапливали коллаген, что указывает на признаки активации мезотелиально-мезенхимального перехода и сходные черты с клеточным ответом эпикарда на острое ишемическое повреждение in vivo.

Заключение. На основе клеточного сфероида разработали и охарактеризовали модель эпикарда, которая может реализовать клеточный ответ на воздействие гипоксического стимула и быть использована для изучения механизмов регуляции эпикардиального микроокружения, тестирования лекарственных препаратов направленного действия.

1. Mendis S., Graham I., Narula J. Addressing the global burden of cardiovascular diseases; need for scalable and sustainable frameworks. Glob Heart. 2022; 17 (1): 48. DOI: 10.5334/gh.1139. PMID: 36051329.

2. Raziyeva K., Kim Y., Zharkinbekov Z., Temirkhanova K., Saparov A. Novel therapies for the treatment of cardiac fibrosis following myocardial infarction. Biomedicines. 2022; 10 (9): 2178. DOI: 10.3390/biomedicines10092178.

3. Scridon A., Balan A.I. Targeting myocardial fibrosisa magic pill in cardiovascular medicine? Pharmaceutics. 2022; 14 (8): 1599. DOI: 10.3390/pharmaceutics14081599. PMID: 36015225.

4. Braitsch C.M., Kanisicak O., van Berlo J.H., Molkentin J.D., Yutzey K.E. Differential expression of embryonic epicardial progenitor markers and localization of cardiac fibrosis in adult ischemic injury and hypertensive heart disease. J Mol Cell Cardiol. 2013; 65: 108–119. DOI: 10.1016/j.yjmcc.2013.10.005. PMID: 24140724.

5. Wei X., Hou Y., Long M., Jiang L., Du Y. Molecular mechanisms underlying the role of hypoxia-inducible factor-1 α in metabolic reprogramming in renal fibrosis. Front Endocrinol (Lausanne). 2022; 13: 927329. DOI: 10.3389/fendo.2022.927329. PMID: 35957825.

6. Steiner C.A., Cartwright I.M., Taylor C.T., Colgan S.P. Hypoxia-inducible factor as a bridge between healthy barrier function, wound healing, and fibrosis. Am J Physiol Cell Physiol. 2022; 323 (3): C866-C878. DOI: 10.1152/ajpcell.00227.2022. PMID: 35912990.

7. van den Berg N.W.E., Kawasaki M., Fabrizi B., Nariswari F.A., Verduijn A.C., Neefs J., Wesselink R., Al-Shama R.F.M., van der Wal A.C., de Boer O.J., Aten J., Driessen A.H.G., Jongejan A., de Groot J.R. Epicardial and endothelial cell activation concurs with extracellular matrix remodeling in atrial fibrillation. Clin Transl Med. 2021; 11 (11): e558. DOI: 10.1002/ctm2.558. PMID: 34841686.

8. Ismail A., Saliba Y., Fares N. Early development of cardiac fibrosis in young old-father offspring. Oxid Med Cell Longev. 2022; 2022: 8770136. DOI: 10.1155/2022/8770136. PMID: 36193084.

9. Дергилев К.В., Комова А.В., Цоколаева З.И., Белоглазова И.Б., Парфенова Е.В. Эпикард как новая мишень для регенеративных технологий в кардиологии. Гены и клетки. 2020; 14 (2): 33–40. DOI: 10.23868/202004016

10. Дергилев К.В., Цоколаева З.И., Белоглазова И.Б., Ратнер Е.И., Молокотина Ю.Д., Парфенова Е.В. Характеристика ангиогенных свойств с-kit+ клеток миокарда. Гены и клетки. 2018; 14 (3): 86–93. DOI: 10.23868/201811038.

11. Dergilev K.V., Tsokolaeva Z.I., Beloglazova I.B., Ratner E.I., Parfenova E.V. Transforming growth factor beta (TGF-β1) induces pro-reparative phenotypic changes in epicardial cells in mice. Bull Exp Biol Med. 2021; 170 (4): 565–570. DOI: 10.1007/s10517-021-05107-5. PMID: 33730328.

12. Massimini M., Romanucci M., De Maria R., Della Salda L. Histological evaluation of long-term collagen type I culture. Methods Mol Biol. 2022; 2514: 95–105. DOI: 10.1007/978-10716-2403-6_10. PMID: 35771422.

13. Maselli D., Matos R.S., Johnson R.D., Chiappini C., Camelliti P., Campagnolo P. Epicardial slices: an innovative 3D organotypic model to study epicardial cell physiology and activation. NPJ Regen Med. 2022; 7 (1): 7. DOI: 10.1038/s41536021-00202-7. PMID: 35039552.

14. Kalluri R., Neilson E.G. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis. J Clin Invest. 2003; 112 (12): 1776–1784. DOI: 10.1172/JCI20530. PMID: 14679171.

15. Liu Y. Epithelial to mesenchymal transition in renal fibrogenesis: pathologic significance, molecular mechanism, and therapeutic intervention. J Am Soc Nephrol. 2004; 15 (1): 1–12. DOI: 10.1097/01.asn.0000106015.29070.e7. PMID: 14694152.

16. Iwano M., Neilson E.G. Mechanisms of tubulointerstitial fibrosis. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2004; 13 (3): 279–284. DOI: 10.1097/00041552-200405000-00003. PMID: 15073485.

17. Strutz F., Okada H., Lo C.W., Danoff T., Carone R.L., Tomaszewski J.E., Neilson E.G. Identification and characterization of a fibroblast marker: FSP1. J Cell Biol. 1995; 130 (2): 393–405. DOI: 10.1083/jcb.130.2.393. PMID: 7615639.

18. Higgins D.F., Kimura K., Bernhardt W.M., Shrimanker N., Akai Y., Hohenstein B., Saito Y., Johnson R.S., Kretzler M., Cohen C.D., Eckardt K-U., Iwano M., Haase V.H. Hypoxia promotes fibrogenesis in vivo via HIF-1 stimulation of epithelial-tomesenchymal transition. J Clin Invest. 2007; 117 (12): 3810–3820. DOI: 10.1172/JCI30487. PMID: 18037992.

19. Orphanides C., Fine L.G., Norman J.T. Hypoxia stimulates proximal tubular cell matrix production via a TGF-beta1independent mechanism. Kidney Int. 1997; 52 (3): 637–647. DOI: 10.1038/ki.1997.377. PMID: 9291182.

20. Kietzmann T., Roth U., Jungermann K. Induction of the plasminogen activator inhibitor-1 gene expression by mild hypoxia via a hypoxia response element binding the hypoxia-inducible factor-1 in rat hepatocytes. Blood. 1999; 94 (12): 4177–4185. DOI: 10.1182/blood.V94.12.4177.

21. Higgins D.F., Biju M.P., Akai Y. Wutz A., Johnson R.S., Haase V.H. Hypoxic induction of Ctgf is directly mediated by Hif-1. Am J Physiol Renal Physiol. 2004; 287 (6): F1223–F1232. DOI: 10.1152/ajprenal.00245.2004. PMID: 15315937.