Гетерогенность распределения белка NеuN как признак морфологической персонализации нейронов коры головного мозга (экспериментальное исследование)

Цель исследования. Определить персонализированные морфологические фенотипы нейронов на основании характера распределения нейронального белка NeuN в слоях коры головного мозга.

Материал и методы. Провели гистологическое исследование коры головного мозга крыс (n=10). Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Для визуализации ядерного нейронального белка NeuN применяли иммуногистохимический метод окрашивания. Препараты исследовали с помощью микроскопа и программного обеспечения для анализа изображений.

Результаты. Отметили разнообразную локализацию и интенсивность иммуногистохимического окрашивания NeuN в нейронах коры головного мозга. На основании интенсивности окрашивания NeuN в каждом препарате выделили интенсивно окрашенные, неокрашенные, а также со следовым окрашиванием нейроны. Вопреки определению белка NeuN как ядерного нейронального, NeuN в большей части нейронов локализовался как в ядре, так и в цитоплазме. На основании разнообразной локализации NeuN (иммуногистохимического окрашивания на NeuN) выделили следующие фенотипы нейронов: 1) нейроны с окрашенным ядром, но неокрашенной цитоплазмой; 2) нейроны с окрашенной цитоплазмой, но неокрашенным ядром; 3) нейроны с окрашенной цитоплазмой и ядром; 4) полностью окрашенные нейроны, в которых ядро не визуализировалось; 5) нейроны с окрашенными отростками (дендритами/аксонами). Выявили значимые различия интенсивности окрашивания NeuN-позитивных нейронов в зависимости от локализации в слоях коры головного мозга.

Заключение. Учитывая важную биологическую роль белка NeuN, фенотипы нейронов, выделенные на основании различной локализации NeuN, заслуживают особого внимания исследователей, так как могут свидетельствовать о функциональном состоянии нейронов. Интерпретация отсутствия окрашивания NeuN в нейроне как признака повреждения научно не обоснована. В дальнейших исследованиях с использованием иммуногистохимического окрашивания с антителами к NeuN следует учитывать и подвергать анализу не только общее количество нейронов, в которых отмечена положительная реакция, но и различные их фенотипы.

1. Mullen R. J., Buck C. R., Smith A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 1992; 116 (1): 201–211. DOI: 10.1242/dev.116.1.201. PMID: 1483388.

2. Kim K. K., Adelstein R.S, Kawamoto S. Identification of neuronal nuclei (NeuN) as Fox-3, a new member of the Fox-1 gene family of splicing factors. J Biol Chem. 2009; 284 (45): 31052-31061. DOI: 10.1074/jbc.M109.052969 PMID: 19713214.

3. Alekseeva O. S., Guselnikova V. V., Beznin G. V., Korzhevsky D. E. [Prospects for the application of neun nuclear protein as a marker of the functional state of nerve cells in vertebrates. J Evol Biochem. Phys. 2015; 51: 357–369. DOI: 10.1134/S0022093015050014.

4. Shen C. C., Yang Y. C., Chiao M. T., Cheng W. Y., Tsuei Y. S., Ko J. L. Characterization of endogenous neural progenitor cells after experimental ischemic stroke. Curr Neurovasc Res. 2010; 7 (1): 6–14. DOI: 10.2174/156720210790820208.

5. Davoli M. A., Fourtounis J., Tam J., Xanthoudakis S., Nicholson D., Robertson G. S., Ng G. Y., Xu D. Immunohistochemical and biochemical assessment of caspase-3 activation and DNA fragmentation following transient focal ischemia in the rat. Neuroscience. 2002; 115 (1): 125–136. DOI: 10.1016/S0306-4522(02)00376-7. PMID: 12401327.

6. Sugawara T., Lewén A., Noshita N., Gasche Y., Chan P. H. Effects of global ischemia duration on neuronal, astroglial, oligodendroglial, and microglial reactions in the vulnerable hippocampal CA1 subregion in rats. J Neurotrauma. 2002; 19: 85–98. DOI: 10.1089/089771502753460268. PMID: 11852981.

7. Alekseeva O. S., Gusel’nikova V. V., Beznin G. V., Korzhevskii D. E. [Prospects of the nuclear protein NeuN application as an index of functional state of the vertebral nerve cells]. Zh Evol Biokhim Fiziol. 2015; 51 (5): 313–323. (in Russ.). PMID: 26856070.

8. Duan W., Zhang Y. P., Hou Z., Huang C., Zhu H., Zhang C. Q., Yin Q. Novel insights into NeuN: from neuronal marker to splicing regulator. Mol Neurobiol. 2016; 53: 1637–1647. DOI: 10.1007/s12035-015-9122-5. PMID: 25680637.

9. Kim K. K., Adelstein R. S., Kawamoto S. Identification of neuronal nuclei (NeuN) as Fox-3, a new member of the Fox-1 gene family of splicing factors. J Biol Chem. 2009; 284: 31052–31061. DOI: 10.1074/jbc.M109.052969. PMID: 19713214.

10. Unal-Cevik I., Kilinç M., Gürsoy-Ozdemir Y., Gurer G., Dalkara T. Loss of NeuN immunoreactivity after cerebral ischemia does not indicate neuronal cell loss: A cautionary note. Brain Res. 2004; 1015: 169–174. DOI: 10.1016/j.brainres.2004.04.032. PMID: 15223381.

11. Babkina A. S., Yadgarov M. Y., Lyubomudrov M. A., Ostrova I. V., Volkov A. V., Kuzovlev A. N., Grechko A. V., et al. Morphologic findings in the cerebral cortex in COVID-19: association of microglial changes with clinical and demographic variables. Biomedicines. 2023; 11 (5): 1407. DOI: 10.3390/biomedicines11051407. PMID: 37239078.

12. Lin Y. S., Kuo K. T., Chen S. K., Huang H. S. RBFOX3/NeuN is dispensable for visual function. PLoS One. 2018; 13 (2): e0192355. DOI: 10.1371/journal.pone.0192355. PMID: 29401485.

13. Maxeiner S., Glassmann A., Kao H. T., Schilling K. The molecular basis of the specificity and cross-reactivity of the NeuN epitope of the neuron-specific splicing regulator, Rbfox3. Histochem Cell Biol. 2014; 141: 43–55. DOI: 10.1007/s00418-013-1159-9. PMID: 24150744.

14. Van Nassauw L., Wu M., De Jonge F., Adriaensen D., Timmermans J. P. Cytoplasmic, but not nuclear, expression of the neuronal nuclei (NeuN) antibody is an exclusive feature of Dogiel type II neurons in the guinea-pig gastrointestinal tract. Histochem. Cell Biol. 2005; 124: 369–377. DOI: 10.1007/s00418-005-0019-7. PMID: 16049694.

15. Yu P., McKinney E. C., Kandasamy M. M., Albert A. L., Meagher R. B. Characterization of brain cell nuclei with decondensed chromatin. Dev Neurobiol. 2015; 75 (7): 738–756. DOI: 10.1002/dneu.22245. PMID: 25369517.

16. Azevedo F. A., Carvalho L. R., Grinberg L. T., Farfel J. M., Ferretti R. E., Leite R. E., Jacob Filho W., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J Comp Neurol. 2009; 513 (5): 532–541. DOI: 10.1002/cne.21974. PMID: 19226510.

17. Hernandez M. L., Chatlos T., Gorse K. M., Lafrenaye A. D. Neuronal membrane disruption occurs late following diffuse brain trauma in rats and involves a subpopulation of NeuN negative cortical neurons. Front Neurol. 2019; 10: 1238. DOI: 10.3389/fneur.2019.01238. PMID: 31824411.

18. Cannon J. R., Greenamyre J. T. NeuN is not a reliable marker of dopamine neurons in rat substantia nigra. Neurosci Lett. 2009; 464 (1): 14–17. DOI: 10.1016/j.neulet.2009.08.023. PMID: 19682546.

19. Unal-Cevik I., Kilinç M., Gürsoy-Ozdemir Y., Gurer G., Dalkara T. Loss of NeuN immunoreactivity after cerebral ischemia does not indicate neuronal cell loss: a cautionary note. Brain Res. 2004; 1015 (1–2): 169–174. DOI: 10.1016/j.brainres.2004.04.032. PMID: 15223381.

20. Yagi S., Splinter J. E.J., Tai D., Wong S., Wen Y., Galea L. A. M. Sex differences in maturation and attrition of adult neurogenesis in the hippocampus. eNeuro. 2020; 7 (4): ENEURO.0468-19.2020. DOI: 10.1523/ENEURO.0468-19.2020. PMID: 32586842.

21. Demarest T. G., Waite E. L., Kristian T., Puche A. C., Waddell J., McKenna M. C., Fiskum G. Sex-dependent mitophagy and neuronal death following rat neonatal hypoxia-ischemia. Neuroscience. 2016; 335: 103–113. DOI: 10.1016/j.neuroscience.2016.08.026. PMID: 27555552.

22. Sugiura A., Shimizu T., Kameyama T., Maruo T., Kedashiro S., Miyata M., Mizutani K., et al. Identification of Sox2 and NeuN double-positive cells in the mouse hypothalamic arcuate nucleus and their reduction in number with aging. Front Aging Neurosci. 2021; 12: 609911. DOI: 10.3389/fnagi.2020.609911. PMID: 33776740.

23. Luijerink L., Waters K. A., Machaalani R. Immunostaining for NeuN does not show all mature and healthy neurons in the human and pig brain: focus on the hippocampus. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2021; 29: e46–e56. DOI: 10.1097/PAI.0000000000000925. PMID: 33710124.

24. McPhail L. T., McBride C. B., McGraw J., Steeves J. D., Tetzlaff W. Axotomy abolishes NeuN expression in facial but not rubrospinal neurons. Exp Neurol. 2004; 185 (1): 182–190. DOI: 10.1016/j.expneurol.2003.10.001. PMID: 14697329.

25. Lavezzi A. M., Corna M. F., Matturri L. Neuronal nuclear antigen (NeuN): a useful marker of neuronal immaturity in sudden unexplained perinatal death. J Neurol Sci. 2013; 329 (1–2): 45–50. DOI: 10.1016/j.jns.2013.03.012. PMID: 23570982.

26. Anderson M. B., Das S., Miller K. E. Subcellular localization of neuronal nuclei (NeuN) antigen in size and calcitonin gene-related peptide (CGRP) populations of dorsal root ganglion (DRG) neurons during acute peripheral inflammation. Neurosci Lett. 2021: 24; 760: 135974. DOI: 10.1016/j.neulet.2021.135974. PMID: 34146639.