Оценка структурных изменений мембран нейтрофилов под действием сыворотки от новорожденных пациентов с воспалительным процессом

Цель исследования: выявить характеристики мембран нейтрофилов, которые могут стать клиническими биомаркерами развития инфекционно-септических осложнений у новорожденных.

Материалы и методы. Объектом исследования были нейтрофилы, выделенные из крови здоровых доноров. Проводили инкубацию клеток с плазмой новорожденных, разделенных на три группы: условно-здоровые (NS) (n=6), с локальной (LIS) (n=7) и генерализованной (GIS) инфекцией (n=8). Оценивали морфологию клеток и шероховатость мембран до и после стимуляции форбол-12-миристат13-ацетатом (PMA) с использованием флуоресцентной и атомно-силовой микроскопии. Определяли площади ядер и мембран нейтрофилов, степень активации к образованию внеклеточных нейтрофильных ловушек (NET), а также параметр шероховатости мембраны (Ra).

Результаты. Разработали и стандартизировали методику подготовки и оценки нейтрофилов. В ходе экспериментов оптимизировали условия среды: 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) обеспечил минимальную фоновую активацию клеток. Выявили дозозависимую активацию нейтрофилов PMA при 1% содержании плазмы. После стимуляции PMA наблюдали значительное увеличение площадей ядер (p0,001) и мембран (p0,001), а также шероховатости поверхности (p0,001), независимо от типа плазмы. Наиболее выраженные изменения отметили у клеток, инкубированных с плазмой пациентов группы GIS. Установили, что при генерализованной инфекции увеличивается склонность нейтрофилов к NET-активации, что может лежать в основе патогенеза тромботических осложнений при сепсисе.

Заключение. Характеристики нейтрофилов, выявленные с помощью микроскопических методов, могут служить перспективными биомаркерами степени тяжести инфекционно-септического процесса у новорожденных.

1. Liu D., Huang S. Y., Sun J. H., Zhang H. C., Cai Q. L., Gao C., Li L., et al. Sepsis-induced immunosuppression: mechanisms, diagnosis and current treatment options. Mil Med Res. 2022; 9 (1): 56. DOI: 10.1186/s40779-022-00422-y. PMID: 36209190.

2. Понасенко А. В., Синицкий М. Ю., Хуторная М. В., Барбараш О. Л. Генетические макеры системной воспалительной реакции в кардиохирургии (обзор). Общая реаниматология. 2017; 13 (6): 48–59.

3. Mellhammar L., Wollter E., Dahlberg J., Donovan B., Olséen C.-J., Wiking P. O., Rose N., et al. Estimating sepsis incidence using administrative data and clinical medical record review. JAMA Netw Open. 2023; 6 (8): e2331168. DOI: 10.1001/jamanetworkopen.2023.31168. PMID: 37642964.

4. Образцов И. В., Рябов А. Ю., Цуранова Н. С., Балыкова Е. В., Парамонов А. И. Функциональная активность нейтрофилов у пациентов с послеоперационными инфекционно-септическими осложнениями. Российский иммунологический журнал. 2019; 22 (4): 1393–401.

5. Celik I. H., Hanna M., Canpolat F. E., Mohan Pammi. Diagnosis of neonatal sepsis: the past, present and future. Pediatr Res. 2022; 91 (2): 337–350. DOI: 10.1038/s41390-021-01696-z. PMID: 34728808.

6. Glaser M. A., Hughes L. M., Jnah A., Newberry D. Neonatal sepsis: a review of pathophysiology and current management strategies. Adv Neonatal Care. 2021; 21 (1): 49–60. DOI: 10.1097/ANC.0000000000000769. PMID: 32956076.

7. Образцов И. В., Жиркова Ю. В., Черникова Е. В., Крапивкин А. И., Брунова О. Ю., Абдраисова А. Т., Давыдова Н. В. Значение функционального анализа фагоцитов для диагностики неонатального сепсиса. Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2023; 68 (1): 24–29.

8. Ohbuchi A., Kono M., Kitagawa K., Takenokuchi M., Imoto S., Saigo K. Quantitative analysis of hemin-induced neutrophil extracellular trap formation and effects of hydrogen peroxide on this phenomenon. Biochem Biophys Reports. 2017; 11: 147–153. DOI: 10.1016/j.bbrep.2017.07.009. PMID: 28955779.

9. Parker H., Winterbourn C. C. Reactive oxidants and myeloperoxidase and their involvement in neutrophil extracellular traps. Front Immunol. 2012; 3: 424. DOI: 10.3389/fimmu.2012.00424. PMID: 23346086.

10. Zhang J., Shao Y., Wu J., Zhang J., Xiong X., Mao J.,Wei Y., et al. Dysregulation of neutrophil in sepsis: recent insights and advances. Cell Commun Signal. 2025; 23 (1): 87. DOI: 10.1186/s12964-025-02098-y. PMID: 39953528.

11. Sergunova V., Inozemtsev V., Vorobjeva N., Kozlova E., Sherstyukova E., Lyapunova S., Chernysh A. Morphology of neutrophils during their activation and NETosis: atomic force microscopy study. Cells. 2023; 12 (17): 2199. DOI: 10.3390/cells12172199. PMID: 37681931.

12. Dewitt S., Hallett M. Leukocyte membrane «expansion»: a central mechanism for leukocyte extravasation. J Leukoc Biol. 2007; 81 (5): 1160–4. DOI: 10.1189/jlb.1106710. PMID: 17360954.

13. Hallett M. B., Dewitt S. Ironing out the wrinkles of neutrophil phagocytosis. Trends Cell Biol. 2007; 17 (5): 209–14. DOI: 10.1016/j.tcb.2007.03.002. PMID: 17350842.

14. Гребенчиков О. А., Касаткина И. С., Каданцева К. К., Мешков М.A., Баева А. А. Влияние лития хлорида на активацию нейтрофилов под действием сыворотки пациентов с септическим шоком. Общая реаниматология. 2020; 16 (5): 45–55.

15. Образцов И. В., Годков М. А., Кулабухов В. В., Владимирова Г. А., Измайлов Д. Ю., Проскурнина Е. В. Функциональная активность нейтрофилов при ожоговом сепсисе. Общая реаниматология. 2017; 13 (2): 40–51.

16. Starostin D. O., Kuzovlev A. N., Dolgikh V. T., Grebenchikov O. A., Polyakov P. A., Grechko A. V. Influence of sevoflurane on neutrophils in patients with sepsis. Russ J Anesthesiol Reanimatol. (in Russ.&Eng.). 2024; (5): 50. DOI: 10.17116/anaesthesiology202405150.

17. Liu S., Han Y., Kong L., Wang G., Ye Z. Atomic force microscopy in disease‐related studies: exploring tissue and cell mechanics. Microsc Res Tech. 2024; 87 (4): 660–684. DOI: 10.1002/jemt.24471. PMID: 38063315.

18. Dumitru A. C., Koehler M. Recent advances in the application of atomic force microscopy to structural biology. J Struct Biol. 2023; 215 (2): 107963. DOI: 10.1016/j.jsb.2023.107963. PMID: 37044358.

19. Kerdegari S., Canepa P., Odino D., Oropesa-Nuñez R., Relini A., Cavalleri O., Canale C. Insights in cell biomechanics through atomic force microscopy. Materials (Basel). 2023; 16 (8): 2980. DOI: 10.3390/ma16082980. PMID: 37109816.

20. Sokolov I., Iyer S., Woodworth C. D. Recovery of elasticity of aged human epithelial cells in vitro. Nanomedicine. 2006; 2 (1): 31–36. DOI: 10.1016/j.nano.2005.12.002. PMID: 17292113. 21. Pérez-Domínguez S., Kulkarni S. G., Rianna C., Radmacher M. Atomic force microscopy for cell mechanics and diseases. Neuroforum. 2020; 26 (2): 101–109. DOI: 10.1515/nf-2020-0001.

21. Makarova N., Kalaparthi V., Seluanov A., Gorbunova V., Dokukin M. E., Sokolov I. Correlation of cell mechanics with the resistance to malignant transformation in naked mole rat fibroblasts. Nanoscale. 2022; 14 (39): 14594–14602. DOI: 10.1039/D2NR01633h. PMID: 36155714.

22. Burn G. L., Foti A., Marsman G., Patel D. F., Zychlinsky A. The Neutrophil. Immunity. 2021; 54 (7): 1377–1391. DOI: 10.1016/j.immuni.2021.06.006. PMID: 34260886.

23. Tilley D. O., Abuabed U., Arndt U. Z., Schmid M., Florian S., Jungblut P. R., Brinkmann V., et al. Histone H3 clipping is a novel signature of human neutrophil extracellular traps. Elife. 2022; 11: e68283. DOI: 10.7554/eLife.68283. PMID: 36282064.

24. Thiam H. R., Wong S. L., Qiu R., Kittisopikul M., Vahabikashi A., Goldman A. E., Goldman R. D., et al. NETosis proceeds by cytoskeleton and endomembrane disassembly and PAD4-mediated chromatin decondensation and nuclear envelope rupture. Proc Natl Acad Sci. 2020; 117 (13): 7326–7337. DOI: 10.1073/pnas.1909546117. PMID: 32170015.

25. Inozemtsev V., Sergunova V., Vorobjeva N., Kozlova E., Sherstyukova E., Lyapunova S., Chernysh A. Stages of NETosis Development upon Stimulation of Neutrophils with Activators of Different Types. Int J Mol Sci. 2023; 24 (15): 12355. DOI: 10.3390/ijms241512355. PMID: 37569729.

26. Wei M., Zhang Y., Wang Y., Liu X., Li X., Zheng X. Employing atomic force nicroscopy (AFM) for microscale investigation of interfaces and interactions in membrane fouling processes: new perspectives and prospects. Membranes (Basel). 2024; 14 (2): 35. DOI: 10.3390/membranes14020035. PMID: 38392662.

27. Миронов В. Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. Нижний Новгород: Российская академия наук, Институт физики микроструктур; 2004: 110.

28. Schneider C. A., Rasband W. S., Eliceiri K. W. NIH Image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 2012; 9 (7): 671–675. DOI: 10.1038/nmeth.2089. PMID: 22930834.

29. Zhou Y., Xu Z., Liu Z. Impact of neutrophil extracellular traps on thrombosis formation: new findings and future perspective. Front Cell Infect Microbiol. 2022; 12: 910908. DOI: 10.3389/fcimb.2022.910908. PMID: 35711663.